Средоварка

Сайт о промышленной биотехнологии

Понедельник, 21.01.2019, 02:56
Меню сайта
Категории раздела
Биотехнология [13]
Микробиология [23]
Разные статьи [15]
Пищевая промышленность [25]
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Главная » Статьи » Биотехнология

3. Спектрофотометрические методы

3. Спектрофотометрические методы

 

Для определения активности ферментов широко применяются спектрофотометрические методы. Эти методы основаны на поглоще­нии света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами ферментов, субстратами или продуктами реакции. Спектры этих соединений могут иметь максимумы поглощения при определенной длине волны как в ультрафиолетовой, так и в видимой области. Положение максимума поглоще­ния определяется наличием в исследуемом материале определенных групп, например циклических или линейных систем с сопряженны­ми двойными связями. Для измерения спектров используют специ­альные приборы — фотометрические абсорбциометры, спектрофото­метры типов «Бекман», «СФ-4» и др. Спектрофотометрический метод имеет преимущества перед другими ввиду высокой чувствительно­сти, быстроты определения, экономии в расходовании фермента и реактивов. В некоторых случаях растворы ферментов после изме­рения активности этим методом могут быть использованы для дальнейшего исследования. Располагая незначительным количеством фермента, с помощью спектрофотометрического метода можно сле­дить за течением реакции во времени. Для этой цели реакционную смесь помещают в кювету, вставленную в термостатируемый кюветодержатель. Через короткие промежутки времени после добавле­ния к реакционной смеси фермента (или субстрата) и быстрого пере­мешивания измеряют поглощение при длине волны, характерной для используемого субстрата или конечного продукта, образующе­гося в данной реакции. Как указывалось, с помощью спектрофото­метрического метода можно измерять непосредственно концентра­цию некоторых ферментов (после достаточной очистки) по величине характерных максимумов поглощения прочно связанных коферментов (простетических групп). Флавиновые ферменты, например, име­ют максимум поглощения при 450 ммк, высота которого обратимо снижается при восстановлении фермента. Изучение изменения спект­ра используется при количественном определении ферментов, со­держащих пиридоксаль-5-фосфат. Известно, что последний, связан­ный с различными апоферментами, показывает при определенных значениях рН ясно выраженный максимум при 410-430 ммк. Свободный пиридоксаль-5-фосфат, отделенный от апофермента, об­ладает при рН 7,0 максимумом при 388 ммк, положение которого смещается в зависимости от рН.

Удельную активность фермента (число единиц активности на единицу веса) можно измерять с помощью спектрофотометриче­ского метода, как указано выше, по изменению спектра субстрата или продукта реакции. Фумаровая кислота, например, за счет присутствия в ее молекуле двойной связи обладает сильным погло­щением при 300 ммк.

Фермент фумаратгидратаза (КФ 4.2.1.2) катализирует взаимо­превращение фумаровой и яблочной кислот, не имеющей двойной связи и максимума при 300 ммк; измерение высоты этого макси­мума применяется для определения удельной активности (количе­ства) фермента.

Спектрофотометрический метод широко используют при опреде­лении многих окислительных ферментов, например дегидрогеназ, которые действуют с участием никотинамидных коферментов, имею­щих в восстановленной форме (НАД-Н2; НАДФ-Н2) максимум по­глощения при 340 ммк, а также при определении цитохромов, обла­дающих в восстановленной форме ясно выраженными максимумами поглощения в видимой части спектра.

В тех случаях, когда действие исследуемого фермента А не со­провождается изменениями в спектре реакционной смеси, но про­дукт, образующийся при его действии, может служить акцептором или донатором для НАДФ-специфической дегидрогеназы Б, внесе­ние в реакционную смесь очищенного препарата фермента Б и соответствующего кофермента позволяет применить спектрофото­метрический метод для непрямого определения фермента А с ис­пользованием эмпирического калибровочного графика. Так, на­пример, измерение активности аспартат-глутамат-трансаминазы в реакции с аспарагиновой и кетоглутаровой кислотами с помощью спектрофотометрического метода можно проводить: 1) прямым пу­тем, измеряя поглощение образующейся в реакции щавелевоуксусной кислоты, имеющей максимум поглощения при 280 ммк; 2) не­прямым путем — либо по образующейся глутаминовой кислоте, определяемой посредством добавления препарата глутаматдегидрогеназы и НАД, либо по приросту щавелевоуксусной кислоты, до­бавляя НАД-Н2 и малатдегидрогеназу; в первом случае измеряют количество образующегося НАД-Н2 (прирост поглощения при 340 ммк), во втором — скорость окисления НАД-Н2 (убыль погло­щения при 340 ммк) за единицу времени. Для целей определения ферментов могут быть использованы не только измерение поглоще­ния света, но также измерение флуоресценции — спектрофлуорометрический метод. Спектрофлуорометрическое определение актив­ности фермента в ряде случаев по чувствительности превосходит спектрофотометрические методы на целый порядок величины. Изве­стно, что некоторые коферменты и субстраты обладают сильной флуоресценцией. НАД и НАДФ в восстановленном состоянии имеют сильную флуоресценцию и не флуоресцируют в окисленной форме, н то время как флавиновые ферменты флуоресцируют в окислен­ном состоянии. Спектрофлуорометрия широко используется как для изучения кинетики и механизма действия никотинамидных и флавиновых ферментов, так и для их гистохимического определения.

 

Источник: «Ферменты». Под ред. академика А. Е. Браунштейна. М., «Наука», 1964.

 

Категория: Биотехнология | Добавил: Irina (03.06.2015)
Просмотров: 1589 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Вход на сайт
Поиск
Друзья сайта
  • Официальный блог
  • Сообщество uCoz
  • FAQ по системе
  • Инструкции для uCoz