Средоварка

Сайт о промышленной биотехнологии

Понедельник, 21.01.2019, 01:55
Меню сайта
Категории раздела
Биотехнология [13]
Микробиология [23]
Разные статьи [15]
Пищевая промышленность [25]
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Главная » Статьи » Биотехнология

5. Единицы ферментов и определение белка

5. Единицы ферментов и определение белка

 

Единицы ферментов

Обычно за относительную меру количества фермента принимает­ся то количество его, выраженное в условных единицах, которому соответствует скорость ферментативной реакции при заданных усло­виях определения активности. При определении степени очистки фермента необходимо рассчитать число единиц активности на единицу веса сухого препарата или содержащегося в нем белка (удель­ная активность фермента). Когда фермент получен в чистом состоя­нии и определена его молекулярная активность, измерение удель­ной активности менее очищенных препаратов позволяет рассчитать абсолютное содержание фермента в исследуемом материале. В про­шлом, к сожалению, не было единообразия ни в выборе условий измерения активности ферментов, ни в способе выражения соотношения между скоростями реакции и числом единиц фермента. Для разных ферментов (а иногда для одного и того же) предлагались крайне разнородные условные единицы, в зависимости от использованного метода определения скорости реакции. Произвольными были и меры величины химического превращения, а также интер­вал времени и масса препарата, к которой это превращение отно­сится.

Правила, рекомендованные в 1961 г. Комиссией по ферментам Международного биохимического союза, позволяют унифицировать величины, в которых выражается количество ферментов. Согласно этим правилам, за единицу (Е) любого фермента принимается то количество его, которое катализирует превращение одного мик­ромоля субстрата в минуту при оптимальных условиях. Если в молекуле субстрата — белка, полисахарида и т. п. — фермент ата­кует более одной связи, то вместо «микромоль субстрата» следует указать «микроэквивалент затронутых реакцией групп». Скорость реакции рекомендуется измерять при температуре 30°; прочие усло­вия (рН, концентрация субстратов и т. п.) должны быть по возмож­ности оптимальными; активность фермента следует оценивать по начальной скорости реакции.

Удельная активность ферментного препарата выра­жается числом единиц на 1 мг белка; концентрация фермен­та в растворе — числом единиц на 1 мл. Молекулярной активностью называется число ферментных единиц в 1 мкм чистого фермента (равное числу молекул субстрата, превращаемых в 1 мин. одной молекулой фермента). Когда измерению доступна абсолютная концентрация простетической группы или каталитиче­ски активного центра, то возможно рассчитать в тех же величинах активность каталитического центра, т. е. чис­ло молекул субстрата, превращаемых в 1 мин. одним каталитиче­ским центром.

 

Определение белка и учет результатов в опытах по выделению ферментов

Как отмечено выше, нарастание удельной активности, выражаю­щейся числом единиц фермента в 1 мг белка, свидетельствует о повышении степени чистоты фермента при его выделении. Ввиду этого при препаративном выделении фермента важно не только избрать быстрый метод определения его активности, но также по­добрать подходящий метод определения белка. В настоящее время для этой цели используют несколько химических и физических методов. В основу ряда фотометрических методов положено фиоле­товое окрашивание, развивающееся в присутствии белка и щелоч­ного раствора сернокислой меди (биуретовая реакция); оно обуслов­лено наличием пептидных связей в белках. Эта реакция свойствен­на всем белкам; однако чувствительность ее недостаточна; для обнаружения белка необходимо иметь раствор, содержащий 100-500 мкг белка в 1 мл. Развитие синего окрашивания в присутствии белка и реактива Фолина происходит при взаимодействии послед­него с ароматическими аминокислотами, имеющимися в белке. Эта реакция использована для определения белка в методе Фолина-Чокалтеу. Поскольку содержание ароматических аминокислот в различных белках неодинаково, реакция не дает однозначной меры количества белка. По той же причине затруднительна количест­венная трактовка данных спектрофотометрического определения белка, основанного на свойстве ароматических аминокислот (тиро­зина и триптофана) поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны 280 ммк. Обычно этот метод применяют для быстрых ориентировочных определений, например, для регистрации концентра­ции белка во фракциях, выходящих из колонок при разделении ферментов методами ионообменной хроматографии и электрофоре­за. Турбидиметрические методы, основанные на определении мут­ности растворов, появляющейся при осаждении белков трихлоруксусной или сульфосалициловой кислотами не являются точными, поскольку эти кислоты не осаждают полностью некоторые белки даже при прогревании, а также вследствие неравномерности флокуляции осадков. Наиболее чувствительным, специфичным и удоб­ным для быстрого определения белка является фотометрический ме­тод Лоури, сочетающий биуретовую реакцию с реакцией Фолина. После определения числа единиц фермента и содержания белка в препаратах на разных ступенях очистки полученные результаты для удобства представляют в общей таблице, содержащей несколь­ко граф, в которых указываются последовательные операции обра­ботки, количество белка в полученных фракциях, их общая активность, степень очистки или удельная активность и процент выхода активности. Данные последней графы вычисляются обычно исходя из общей активности исходного раствора, принимаемой за 100. Для иллюстрации ниже приводится подобная таблица итогов очистки и выделения кристаллического препарата цистатионазы (гомосериндегидратазы, КФ 4.2.1.15) из 1,5 кг печени крыс.

 

Ход очистки цистатионазы

Стадия очистки

Общая активность, ед.

Белок, мг

Удельная активность, ед./мг

Выход фермента, %

Исходный гомогенат

3,27×105

5,22×105

0,6

100

Прогретый экстракт

2,62×105

2,43×105

1,1

80

Фракционирование (NH4)2SO4

1,94×105

3,73×104

5,1

59

Первое осаждение спиртом

1,42×105

5,65×103

25

43,5

Второе осаждение спиртом

1,30×105

8,20×102

259

40

Фракционирование протамином

1,27×105

5,22×102

244

39

Кристаллизация

6,25×104

2,13×102

293

19

Перекристаллизация

4,60×104

1,33×102

346

14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обычно для получения максимально очищенного препарата фермента используют 8-10 различных операций. При этом удельная активность фермента может быть повышена в сотни и тысячи раз при потере общей активности, доходящей в некоторых случаях до 80-90%. Если значительная потеря активности наблюдается уже на первых стадиях очистки, то необходимо установить, не происходит ли при выделении ферментов потери необходимых кофакторов; в таком случае дальнейшую очистку фермента (или измерение его активности) необходимо проводить с их добавлением.

 

Источник: «Ферменты». Под ред. академика А. Е. Браунштейна. М., «Наука», 1964.

 

 

Категория: Биотехнология | Добавил: Irina (12.06.2015)
Просмотров: 1439 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Вход на сайт
Поиск
Друзья сайта
  • Официальный блог
  • Сообщество uCoz
  • FAQ по системе
  • Инструкции для uCoz