Средоварка

Сайт о промышленной биотехнологии

Понедельник, 21.01.2019, 02:52
Меню сайта
Категории раздела
Биотехнология [13]
Микробиология [23]
Разные статьи [15]
Пищевая промышленность [25]
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Главная » Статьи » Биотехнология

Как получают иммобилизованные ферменты?

Как получают иммобилизованные ферменты?


Что такое промышленная биотехнология?
Определения биотехнологии в Интернете
Объекты биотехнологии: от вирусов до человека
Биореакторы
Словарь терминов биотехнологии
Сайты о биотехнологии
Где применяют иммобилизованные ферменты?

Иммобилизированные ферменты (от лат. immobilis – неподвижный) это ферменты, прикрепленные к носителю (как правило, полимеру), и сохраняющие при этом свои каталитические свойства. Такой фермент легко отделить от реакционной среды, его можно использовать многократно, он не загрязняет готовый продукт. Также иммобилизация позволяет изменять свойства фермента — активность, специфичность и другие.


Существует два основных способа иммобилизации ферментов: физический и химический. При химическом способе фермент закрепляется на носителе за счет ковалентных связей. При физической иммобилизации фермент адсорбируется на поверхности носителя или удерживается на нем механически (внутри поры геля).

 

 

Физические способы иммобилизации

 

Нерастворимые носители

Фермент можно адсорбировать на твердом носителе за счет электростатических, гидрофобных или водородных связей. Именно с физической адсорбции началась в 1916 г. история иммобилизованных ферментов. Этот метод до сих пор используется во многих отраслях промышленности.

Удастся ли белку прочно прикрепиться к носителю, зависит от двух особенностей этого носителя: удельной поверхности и количества пор. Чем больше удельная поверхность, тем больше «посадочных мест» для белка; чем лучше развиты поры, тем ему легче закрепиться.

Водный раствор фермента просто помещают на подложку, либо смешивают с частицами носителя, или пропускают через заполненные носителем колонки. Например, осадок гидроксида титана заливают раствором фермента, перемешивают и сушат. При этом каждый грамм осадка впитывает не менее 64 мг белка.

Физическая адсорбция хороша тем, что полностью сохраняет активность фермента – ведь молекула его не образует новых химических связей, а значит не изменяется. Оборотной стороной этого достоинства является невысокая прочность прикрепления белка. Он сравнительно легко отрывается от поверхности, что приводит не только к потере самого фермента, но и к загрязнению продуктов реакции.

Прочность повышают, заранее обрабатывая носитель ионами металлов, полимерами, гидрофобными соединениями, покрывая его слоем белка или липида. Можно обработать и сам фермент, но это снижает его активность.

Носители: кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетичес­кие полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов, целлюлоза, декстрановые гели (сефароза, агароза).

 

Гели

Самый простой способ иммобилизовать фермент – включить его в трехмерную матрицу геля. Этот способ подходит не только для отдельных ферментов, но и для их комплексов и даже целых клеток.

Есть два способа включения фермента в гель. Чтобы получить гель, нужно сначала соединить отдельные молекулы в полимерные цепочки, а затем сплести из этих цепочек трехмерную структуру. Таким образом, процесс имеет две стадии, и на каждой из них может быть добавлен фермент. Можно ввести его в водный раствор будущего носителя, а затем провести их совместную полимеризацию. При этом молекулы белка сами собой окажутся в толще геля. Другой подход – введение фермента в уже готовый полимер. Затем из него получают гель, несущий в себе фермент.

Преимущество иммобилизации в геле – равномерное распределение фермента во всем объеме носителя. Кроме того, большинство гелей устойчиво к механическому, химическому, тепловому воздействию. Включенный в толщу геля фермент можно использовать многократно. Естественное ограничение метода – он пригоден только для растворимых в воде субстратов.

Носители: совместная полимеризация с носителем - полиакриламид, поливиниловый спирт, поливинил-пирролидон, силикагель; введение в готовый гель - крахмал, агар-агар, каррагинан, агароза, фос­фат кальция.

 

Фермент застревает в трехмерной структуре геля, как рыба в сети.

 

Мембраны

Фермент можно отделить от субстрата полупроницаемой перегородкой – мембраной. Мелкие молекулы субстрата будут свободно проходить через нее, а крупные молекулы фермента останутся внутри. Мембрана, в зависимости от состава, может называться микрокапсулой или липосомой.

Микрокапсула состоит из полупроницаемого полимера. Такие оболочки образуются обычно на поверхности раздела двух фаз – водной и органической. Если одно соединение растворено в водной, а другое в органической фазе, то на границе фаз эти вещества конденсируются и образуют слой толщиной в сотые доли микрометра. Размер же всей капсулы составляет десятки-сотни микрометров. Микрокапсулирование – простой метод, позволяющий использовать фермент повторно. Этим способом можно иммобилизовать и мультиферментные комплексы, и части клеток, и даже целые клетки. Однако метод неприменим для слишком крупных молекул субстратов, которые не проходят через мембрану.

Чем отличаются липосомы от микрокапсул? Липосома – это круглая или удлиненная оболочка, образованная двойным слоем липидных молекул (обычно лецитина). Раствор лецитина в органическом растворителе упаривают. Получается тонкая пленка лецитина, которую рассеивают в виде мелких частиц в водном растворе фермента. Эти частицы сами собираются в двуслойные оболочки вокруг молекул фермента.

Липосомы – наиболее естественный способ иммобилизации ферментов, так как в клетке они обычно находятся в липидном слое мембран. Ферменты, включенные в липосомы, применяют в медицине и в научных исследованиях – в том числе для изучения жизнедеятельности клетки.

 

Химические способы иммобилизации

 

Химическая иммобилизация – это создание ковалентных связей между ферментом и носителем. В чем преимущества полученных этого способа? Первое из них – прочность. Ковалентная связь надежно и необратимо прикрепляет фермент к носителю. Какими бы ни были условия реакции – кислотность среды и температура, фермент не отрывается от подложки и не загрязняет целевые продукты. Такое загрязнение недопустимо в производстве лекарств, переработке пищевого сырья, а также при проведении исследований. Второе преимущество – образуя химические связи, можно направленно менять свойства белка. Например, повысить каталитическую активность фермента, стабильность или субстратную специфичность.

Важно, чтобы новые химические связи не затрагивали активный центр фермента. Например, гликопротеины лучше присоединять через углеводную часть, оставляя свободной белковую. Надо иметь в виду, что чем ближе к поверхности носителя находится фермент, тем труднее молекуле субстрата к нему подобраться. Поэтому часто фермент соединяют с носителем не напрямую, а через вставку (сшивку). Сшивками могут быть молекулы с двумя или несколькими функциональными группами, способные держаться одновременно за белок и носитель. Это могут быть бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид. Они образуют ковалентные связи как с белком, так и с подложкой.

Белок взаимодействует с носителем своими аминными, гидроксильными и карбоксильными группами.  Носитель для химической иммобилизации необходимо предварительно активировать – бромцианом, азотистой кислотой или цианурхлоридом. После такой обработки на нем появляются функциональные группы, способные захватывать белок. Существуют разные способы химическом иммобилизации, в зависимости от того, за какие группы на поверхности носителя цепляется белок.

При всех достоинствах химической иммобилизации, в промышленности она малоприменима из-за сложности и дороговизны. Этот способ больше подходит для научных исследований.

Аминогруппы. В данном случае используются первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом. Превращенные в соли диазония, они взаимодействуют с множеством радикалов. Это могут быть фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы. Например, фенольные радикалы тирозина в щелочной среде образуют азо-соединения. Этот метод привлекателен тем, что аминогруппы могут быть введены в самые разные носители.

Производные карбоксильной группы. Если на поверхности носителя много ацильных групп, к ним можно прикрепить аминогруппы белка. В этом могут помочь ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот. Лучше всего соединяются с белком галогенангидриды, хуже – эфиры.

Сульфгидрилъные группы. Носитель хорошо удерживает фермент, если у обоих веществ есть сульфгидрильные группы. Они легко окисляются и образуют дисульфидные связи. Для этого достаточно подействовать на них кислородом воздуха.

 

 

Включение в двухфазную среду

 

Особый случай иммобилизации – включение фермента в двухфазную среду. При этом фермент находится только в одной фазе, в которой он растворим. Как правило, такой фазой является водный раствор. Во второй фазе – органической – накапливается продукт реакции. Субстраты и продукты распределяются между обеими фазами. Меняя их соотношение, можно сдвигать равновесие в нужную сторону и тем самым управлять реакцией. Чтобы улучшить взаимодействие между фазами, одну из них диспергируют в другой, увеличивая поверхность раздела. После завершения реакции органическую фазу отделяют и извлекают из нее продукт. Оставшуюся фазу с ферментом можно использовать повторно. Двухфазные системы необходимы при работе с крупными молекулами субстратов, которые не могут взаимодействовать с мелкопористыми носителями.

 

 

Источники:xumuk.ru, vseslova.ru, do.gendocs.ru, biotechnolog.ru, meduniver.com, membrana.ru, rybolovu.com

 

 

Категория: Биотехнология | Добавил: Irina (24.07.2013)
Просмотров: 3032 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Вход на сайт
Поиск
Друзья сайта
  • Официальный блог
  • Сообщество uCoz
  • FAQ по системе
  • Инструкции для uCoz