Средоварка

Сайт о промышленной биотехнологии

Понедельник, 21.01.2019, 02:56
Меню сайта
Категории раздела
Биотехнология [13]
Микробиология [23]
Разные статьи [15]
Пищевая промышленность [25]
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Главная » Статьи » Биотехнология

2. Количественное определение ферментов и их активности

2. Количественное определение ферментов и их активности

 

О присутствии фермента в растворе судят в большинстве случаев по действию его на определенный субстрат (или на определенный тип химической связи в молекуле субстрата) в условиях, оптималь­ных для активности фермента. Как правило, могут быть подобраны такие условия для определения активности, при которых началь­ная скорость исследуемого превращения пропорциональна количе­ству фермента в изучаемой пробе. Таким образом, о количестве фермента судят косвенно по его активности.

Ферменты — протеиды, простетические группы которых окра­шены или обладают другими доступными измерению физическими или химическими свойствами, могут после некоторой очистки опре­деляться прямыми методами, например путем измерения интенсив­ности флюоресценции или характерных полос поглощения в рас­творах. Прежде чем приступить к выделению фермента, необходимо избрать и тщательно отработать метод определения активности, под контролем которого производится выбор наиболее эффективных приемов очистки фермента, а затем и выполнение последовательных стадий его препаративного получения. Большинство ферментов от­личается высокой лабильностью на последних стадиях очистки, когда удалены неактивные белки и другие стабилизирующие фер­мент примеси. Поэтому успех выделения часто зависит от быстроты проведения и контроля операций по очистке. При разработке спо­соба очистки фермента наилучшим методом определения активно­сти является тот, который не занимает много времени и достаточно прост для анализа серийных проб (фракций), хотя он может не отличаться высокой точностью (обычно допустимы погрешности определения до ±5-10%).

При окончательной оценке каталитических свойств чистого фер­мента и степени его обогащения по стадиям фракционирования, ра­зумеется, должны применяться не приближенные, а наиболее точ­ные методы определения активности.

Активность фермента меняется при различных условиях реак­ции и зависит от температуры, рН среды, от концентраций субстратов и кофакторов. Учитывая это, при определении активности фер­мента на разных стадиях очистки необходимо строго соблюдать одни и те же условия. Желательно также не ограничиваться опре­делением активности по одному какому-либо методу. Количество субстрата, превращаемого в условиях теста по определению актив­ности фермента, должно быть пропорционально количеству послед­него и времени инкубирования. Если в реакции такой пропорцио­нальности нет, то активность рассчитывают по предварительно построенному калибровочному графику, отражающему зависимость скорости реакции от количества единиц фермента.

В тех случаях, когда ход реакции не линеен во времени (не соответствует нулевому порядку), следует определять начальную скорость реакции (по тангенсу угла наклона ка­сательной к начальному отрезку кривой превращения). Естествен­но, что это легче всего осуществимо при применении физических и физико-химических методов измерения активности, позволяющих непрерывно следить за ходом превращения во времени, например спектрофотометрических методов, потенциометрических, полярографических и т. п. Как правило, точность измерения начальных скоростей реакции значительно выше, когда определяется накоп­ление продукта превращения, а не убыль исходного субстрата.

Для измерения скорости ферментативной реакции необходимо выбрать буфер, который не тормозит исследуемую активность и обеспечивает поддержание величины рН раствора, близкой к опти­муму для данного фермента. Реакцию принято проводить при тем­пературе, лежащей в большинстве случаев в пределах 25-40°, для ферментов из тканей теплокровных — обычно около 37°; по рекомендации Комиссии по ферментам МБС желательно соблюдение стандартной температуры 30°. При исследовании ферментов, требую­щих присутствия кофакторов (ионов металлов, коферментов и др.), концентрация которых может снижаться по мере разбавления или очистки фермента, в реакционную смесь следует добавлять недостаю­щие кофакторы, например соли магния или других металлов, АТФ, НАДФ, флавинадениндинуклеотид, пиридоксальфосфат, глютатион и т. п. Кроме того, в состав опытных смесей для определения актив­ности ферментов нередко вводят стабилизаторы. Установлено, что во многих случаях добавление желатины, альбумина, глицерина и других добавок предотвращает денатурацию ферментного белка. Присутствие в реакционной смеси аскорбиновой кислоты, тиолов и других восстановителей защищает фермент от окисления, а добавление цистеина, глютатиона, ЭДТА и аналогичных комплексообразователей препятствует отравлению фермента следами металлов. Нередко стабилизирующее действие оказывает добавление специфического субстрата фермента или участвующего в его действии кофактора.

 

Источник: «Ферменты». Под ред. академика А. Е. Браунштейна. М., «Наука», 1964.

 

Категория: Биотехнология | Добавил: Irina (29.05.2015)
Просмотров: 1674 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Вход на сайт
Поиск
Друзья сайта
  • Официальный блог
  • Сообщество uCoz
  • FAQ по системе
  • Инструкции для uCoz