Средоварка

Сайт о промышленной биотехнологии

Понедельник, 21.01.2019, 01:54
Меню сайта
Категории раздела
Строение клетки [2]
Микроорганизмы [4]
Стерилизация [6]
Питательные среды [4]
Практические занятия [7]
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Главная » Статьи » Микробиология » Практические занятия

Части клетки. Окраска по Граму

Части клетки. Окраска по Граму

Стерилизация. Автоклав
Получение чистых культур
Свечение микробов. Разложение белков и углеводов
Рассмотрение посевов. Бактерии, грибы, простейшие
Пересев. Приготовление мазков
Обращение с микроскопом

 

 

 Это занятие посвящается изучению важнейших структурных элементов бакте­риальной   клетки.

 

 

Капсула. Капсула бактерий (см. стр. 42-43) изучается на мазках из селезенки мыши, погибшей от сибирской язвы, которые обрабатываются каждым занимаю­щимся  по методу Ольта.

Мазок фиксируют в смеси спирта с эфиром и вслед за просушкой его на воздухе окрашивают 3 мин. раствором сафранина (профильтрованный свежеприго­товленный 3% раствор сафранина в горячей воде), слегка споласкивают его водой и, не просушивая, покрывают покровным стеклом, следя, чтобы между последним и предметным стеклом была вода. Препарат исследуется при помощи иммерсионной системы (само собой разумеется, что покровное стекло сверху должно быть совер­шенно сухим). Тела бактерий окрашиваются  при этом методе в красный цвет, а капсулы — в желтый.

Споры. Споры исследуют, окрашивая мазки В. subtilisилиВ. anthracis по методу Клейна. Этот метод исходит из положения, что споры в противоположность вегетативным формам бактерий благодаря свойствам своих оболочек или прото­плазмы или тех и другой в совокупности с трудом вступают в физико-химические реакции с различными химическими соединениями, в том числе и с красителями, но если таковые произошли, то разрыв происшедшей связи, удаление из споры краски в противоположность вегетативному телу бактерии происходит с большим трудом.

В пробирке приготовляют достаточно густую взвесь указанных бактерий в физиологическом растворе (2-2,5 см3) и к ней добавляют такое же количество кар­болового фуксина. Смесь нагревается над пламенем до появления паров, по не до кипения жидкости. Затем из нее приготовляют мазок, который подсушивается и фиксируется на огне обычным способом. Фуксин в силу одновременного участия двух факторов (присутствия карболовой кислоты, действующей подобно протраве, и высокой температуры) окрасит споры, что не произошло бы при наличии одной краски без этих факторов. Одновременно, само собой разумеется, окрасятся и вегетативные тела бактерий, в силу чего, чтобы выявить споры изолированно от последних, мазок обрабатываетеся 0,5% раствором серной кислоты путем погруже­ния мазка на 5-10 мин. в стаканчик, наполненный ею, после чего кислота немед­ленно удаляется промыванием водой. Обработка кислотой устранит краску из тела бактерий, но в силу указанных выше моментов не сможет нарушить связи краски со спорами, которые останутся прочно окрашенными. Поэтъму, если на мазок налить метиленовой синьки и оставить ее на 2 мин., а потом слить, промыть водой, подсу­шить на воздухе и рассматривать под микроскопом, то в соответствии с изложенным тело бактерий окажется окрашенным в синий цвет, а споры в красный. При изу­чении препаратов руководствуются стр. 47-48.

Жгутики. Самостоятельное движение осуществляется особыми органами клет­ки — жгутиками, или ресничками. Это движение подлежит нашему изучению путем наблюдения бактерий живыми — методом «висячей капли» и обнаружением под ми­кроскопом жгутиков окрашенными.

Висячая капля готовится следующим образом. На середину покровного стекла наносится не слишком большая капля взвеси однодневной культуры В. соli или В. typhi в воде или в физиологическом растворе или из бульонной культуры, после чего стекло перевертывается каплей вниз и помещается (как бы вися) над углуб­лением предварительно смазанного по краям вазелином особого предметного стекла c луночкой. Покровное стекло осторожно прижимается к вазелину, чтобы капля c бактериями была вполне разобщена с окружающей средой. Таким образом пред­отвращено высыхание капли. Висячая капля устанавливается под микроскопом и, пользуясь системой 3 при суженной диафрагме, находят сначала край капли, который резко выявляется при этих условиях в виде отрезка круга. Передвинув препарат так, чтобы найденный край капли находился в центре поля зрения, изу­чают вслед за эдим каплю, пользуясь иммерсионной системой (рекомендуется под контролем глаза опустить эту систему в масло до соприкосновения с предметным

стеклом и с большой постепенностью поднимать микрометрическим винтом тубус микроскопа до тех пор, пока глаза не увидят отчетливо бактерий).

Одновременно готовят таким же способом препарат висячей капли из В. disenteriae— микроба, лишенного органов движения.

При изучении обоих препаратов (лучше одновременно, для чего при ограничен­ности количества микроскопов рекомендуется объединиться двум товарищам) наблюдатель,  фиксируя   внимание  на  отдельных  особях,  легко  подметит разницу в поведении В. соli или В. typhiи В. disenteriae. Тогда как В. соli или В. typhi,  имеющие жгутики, совершает ясно выраженные активные движения, хотя и на не­больших расстояниях, В. disenteriae, не имея органов движения, является лишь объектом толчков в него движущихся молекул окружающей жидкости и поэтому остается на одном месте, колеблясь лишь из стороны в сторону. При наблюдении следует руководствоваться текстом стр. 49-50 и 81-82. Обнаружение жгутиков,   их видимость как таковых под микроско­пом может быть осуществлена лишь в том случае, если будет увеличен размер поперечника этих образований, так как у бактерий он находится за пределами возможности микроскопического видения. Это достигается такими методами обработки, которые ведут к разбуханию как тела бактерии, так и жгутиков, что доводит раз­меры поперечника до величины, доступной разрешающей силе микроскопа. Микро­биологическая техника для этой цели имеет в своем распоряжении ряд методов, но все они относительно   сложны  и далеко не всегда удаются начинающим, в силу чего   на практических  занятиях   изучаются  уже   готовые   препараты   В. typhiи V. cholerae.

Окраска   по  Граму дает возможность быстро и просто обнаружить различия в физико-химическом составе разнообразных бактерий,  что  помогает различать сходные морфологически виды. Этот метод использует свойство протоплазмы целого ряда бактериальных видов вступать в реакцию с генциан-виолет (или метил-виолет) и иодом с образованием комплекса, не поддающегося диссоциации (обесцвечиванию) при   последующем  действии   спирта.

Приготовляют смесь взвеси В. subtilis и V. choleraeasiaticae, из которых пер­вый положителен по Граму, а второй отрицателен, и из этой смеси делают обычным путем мазок с последующим подсушиванием на воздухе и фиксацией на огне. Затем следуют окраска мазка в течение 2 мин. генциан- или метил-виолет (во избежание осадков в препарате следует предварительно положить на мазок полоску фильтро­вальной бумаги), снятие бумаги и слитие краски, которую заменяют раствором Люголя, остающимся на мазке 1 мин. После слития со стекла раствора Люголя стекло с мазком то погружают, то извлекают из баночки с 96% спиртом, пока не перестанут отходить волны краски (если мазок не слишком толст, это продолжается 0,5-1 мин.), вслед за чем споласкивают мазок водой и окрашивают разведенным фук­сином (1 мин.), после чего удаляют краску водой и просушивают на воздухе. При изучении под микроскопом В. subtilis в силу положительности по Граму оказыва­ется окрашенным в фиолетовый цвет, а отрицательный по Граму V. cholerae— в красный, так как спирт, разрушая соединение протоплазмы V. cholerae с генциан-виолет и иодом, обесцветил этот микроорганизм и позволил ему окраситься дополнительно введенной в опыт красной краской — фуксином.

 

Категория: Практические занятия | Добавил: Irina (31.05.2013)
Просмотров: 1101 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Вход на сайт
Поиск
Друзья сайта
  • Официальный блог
  • Сообщество uCoz
  • FAQ по системе
  • Инструкции для uCoz